Il franchise di Mario presenta numerosi personaggi che vivono nel Regno dei Funghi o in altre località come l'Isola Delfina. Il ruolo di questi personaggi può variare a seconda dei titoli in cui compaiono, secondo uno stile che Shigeru Miyamoto ha attinto da fumettisti quali Osamu Tezuka e Fujio Akatsuka, nonché da Elzie Crisler Segar:
«Se avete presente personaggi come Braccio di Ferro e i fumetti di una volta, ricorderete come spesso i personaggi assumano ruoli diversi, a seconda dell'episodio. Capita che in uno siano uomini d'affari e in un altro dei pirati. A seconda della storia raccontata, il loro ruolo cambiava. Quindi, in un certo senso, vedo i nostri personaggi nello stesso modo, e penso che possano ricoprire ruoli diversi in giochi diversi. Sono più come una grande famiglia, o come una troupe di attori.»
I personaggi di Mario compaiono infatti, oltre che nei classici platform dove l'eroe baffuto deve salvare la principessa, anche in titoli di genere rompicapo, sportivo (in particolare simulatori di guida), di ruolo o educativo.